一、樣本轉移：避免污染與損失

 

樣本從采樣器轉移至處理容器（如培養皿、離心管）時，需同時防范外界污染和目標微生物的損耗：

 

無菌環境操作：

 

轉移需在生物安全柜內進行，操作前用75%酒精消毒采樣器采樣頭、容器表面及操作者手部；使用無菌吸管、移液槍（槍頭需滅菌），避免接觸非無菌區域（如容器外壁）。

 

誤區提示：若在開放環境操作，空氣中的雜菌會混入樣本，導致菌落數虛高，尤其對低濃度樣本影響顯著。

 

采樣液的充分洗脫：

 

對于撞擊式、篩孔式采樣器，采樣后需用無菌洗脫液（如0.85%無菌生理鹽水、磷酸鹽緩沖液PBS）反復沖洗采樣頭（至少3次），確保附著的微生物完全進入洗脫液；渦旋振蕩1~2分鐘（轉速2000~3000rpm），打破微生物聚集的菌團，提高分散度。

 

二、樣本稀釋：保證稀釋倍數的精準性

 

當樣本中微生物濃度較高時，需梯度稀釋以獲得可計數的菌落數（30~300CFU/皿），稀釋過程的誤差會直接影響結果準確性：

 

稀釋液與容器：使用滅菌的梯度稀釋管（如10mL容量的螺旋蓋試管），預裝9mL無菌稀釋液（誤差需≤±0.1mL）；標記清晰稀釋倍數（10?¹、10?²等），避免混淆。

 

操作規范：

 

移液時確保吸管/槍頭尖端接觸液面下1~2cm，避免吸入氣泡；

 

從高濃度向低濃度稀釋時，每一步均需混勻（用手搓動試管10~15次），確保稀釋均勻；

 

同一稀釋倍數做2~3個平行樣，減少隨機誤差。

 

三、培養與計數：控制培養條件，規范計數標準

 

微生物的生長受培養條件影響極大，需嚴格統一參數：

 

培養基選擇與制備：

 

根據目標微生物類型選擇培養基（如檢測細菌用營養瓊脂，真菌用馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA），培養基需滅菌徹底（121℃高壓蒸汽滅菌20分鐘），且pH值符合要求（細菌pH7.2~7.4，真菌pH5.6~5.8），避免因營養缺陷或酸堿不適導致微生物無法生長。

 

培養條件控制：

 

溫度：細菌36±1℃，真菌28±1℃，恒溫培養箱需每日校準溫度（誤差≤±0.5℃）；

 

時間：細菌培養48±2小時，真菌培養72±2小時，避免培養過短導致菌落漏計或過長導致菌落重疊。

 

計數規則：

 

選擇菌落數在30~300CFU的平板計數（低于30則結果誤差大，高于300則菌落易重疊）；

 

若同一稀釋度的平行平板菌落數差值超過1倍（如10?³稀釋度平板菌落數為20和50），需重新檢測；

 

計數時需區分目標微生物與污染菌（可通過菌落形態、染色鏡檢輔助判斷）。

 

四、質量控制：全程驗證可靠性

 

空白對照實驗：

 

每批樣本處理時，設置采樣空白（采樣器不采集空氣，僅用洗脫液沖洗采樣頭后培養）和操作空白（直接將無菌洗脫液接種培養），若空白菌落數>5CFU，說明存在污染，需重新實驗。

 

陽性對照與回收率驗證：

 

定期用已知濃度的標準菌液（如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌）模擬采樣，計算回收率（回收率需在70%~130%之間，否則需檢查采樣器效率或處理流程）。

 

儀器校準：

 

采樣器需定期校準流量（誤差≤±5%），避免因流量不準導致采樣體積偏差；

 

移液槍、培養箱等設備需每年經計量認證，確保參數準確。